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凍干保護劑在蛋白藥物中起了什么作用

冷凍干燥廣泛用于制備治療性蛋白質(zhì)制劑，蛋白凍干制劑可以提供更好的保質(zhì)期，方便藥物的儲藏和運輸，然而，蛋白在凍干過程中存在許多應力，包括低溫應力、凍結(jié)應力(枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等)、干燥應力(失去蛋白質(zhì)表面水分子)等，這些應力常常直接或間接導致蛋白質(zhì)類藥物失去天然構象從而變性或失活。

冷凍干燥保護劑的分類方式很多，有文獻中提出了一個公式化模型，按照功能把冷凍干燥保護劑分類，包括5類:

①pH緩沖劑，如Tris、組氨酸、枸櫞酸等;

②配體，可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的熱力學穩(wěn)定性;

③穩(wěn)定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質(zhì)的展開和提供玻璃基質(zhì)起保護作用;

④非離子表面活性劑，可減少蛋白質(zhì)的聚集;

⑤填充劑，如甘露醇、甘氨酸、***淀粉、血清白蛋白等，可提高產(chǎn)品的物理成型性。這里我們簡要介紹其中幾種。

1、緩沖鹽

首先，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性受環(huán)境pH的影響，緩沖液選擇在蛋白質(zhì)制劑的開發(fā)過程中是最關鍵的，并且必須在配制階段建立。在選擇緩沖液pH時，建議pH不要太接近蛋白質(zhì)的pI(等電點)以避免聚集。

磷酸鹽是蛋白質(zhì)配方中最常見的緩沖劑之一，特別是含水蛋白質(zhì)藥物，有效pH值范圍為5.8-8.0，并且具有生物相容性。然而，正如“冷凍過程中的pH變化"所討論的那樣，磷酸鹽緩沖液，特別是磷酸氫二鈉，在冷凍過程中會發(fā)生顯著的pH變化，因此不推薦用于pH敏感蛋白質(zhì)。

相反，磷酸鉀，組氨酸，三羥甲基氨基甲烷(Tris)和檸檬酸鹽緩沖液在冷凍期間顯示出最小的pH變化。此外，低緩沖液濃度可有助于降低pH變化。組氨酸是一種氨基酸，有效pH范圍為5.5-7.4，它與生物pH相容，并且經(jīng)常用于冷凍干燥的蛋白質(zhì)。然而，選擇適當?shù)睦鋬龈稍锼灾苿?，包括緩沖劑，取決于蛋白質(zhì)的要求及其給藥途徑。

2、填充劑

為了保證冷凍干燥后形成良好的配方結(jié)構防止產(chǎn)品塌陷，同時改善配方溶解性，冷凍干燥保護劑中還需要加入填充劑。首先，填充劑在復溶時應該是充分可溶的并且與制劑中的蛋白質(zhì)藥物相容。此外，它們沒有毒性問題并且具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可有效提高冷凍干燥效率。

甘氨酸和甘露醇經(jīng)常用作凍干蛋白質(zhì)制劑的填充劑。甘氨酸在用作填充劑時具有優(yōu)勢，因為它是無毒的。它具有高共晶/共熔溫度(Teu)，可實現(xiàn)高效冷凍干燥和高溶解度。

甘露醇具有與甘氨酸相同的優(yōu)點，并且對特定蛋白質(zhì)藥物如LDH和轉(zhuǎn)化生長因子-b1具有穩(wěn)定作用，其穩(wěn)定效果取決于其濃度。因此，在選擇填充劑時，應仔細考慮穩(wěn)定效果以及粉餅外觀。大多數(shù)氨基酸容易結(jié)晶并且可以潛在地用作填充劑以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，然而，酸鹽的形成阻礙了它們的結(jié)晶。NaCl是另一種結(jié)晶劑，但其共熔溫度(Teu)相對于其他填充劑的而言太低，因此不推薦使用。

對于填充劑，應考慮退火步驟。甘氨酸和甘露糖醇在冷凍干燥過程中應以結(jié)晶形式存在。但是在冷凍步驟期間，過冷卻誘導兩種填充劑以無定形形態(tài)凍結(jié)，容易導致粉餅塌陷。另外，在沒有退火的情況下，填充劑可以在初級干燥期間重結(jié)晶造成西林瓶破裂，特別是當制劑中包含高濃度的甘露醇時。填充劑應在非晶相的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)和填充劑的共熔溫度(Teu)之間進行有效結(jié)晶，而退火時間取決于填充劑濃度及其性質(zhì)。對于甘露醇和甘氨酸，填充高度在1cm時，推薦在-20或-25℃和2小時。

3、穩(wěn)定劑

糖類是凍干蛋白質(zhì)制劑中***的賦形劑，因為它們的結(jié)構中具有許多羥基，因此可以通過取代蛋白質(zhì)和水之間的氫鍵來提供穩(wěn)定效果。此外，大多數(shù)糖在正常冷凍干燥條件下不結(jié)晶，導致凍干蛋白質(zhì)制劑更快速復溶。還原性糖通常不用于冷凍干燥，因為它們通過美拉德反應與蛋白質(zhì)反應，然而，當它們的穩(wěn)定性效果優(yōu)于其他賦形劑時，它們可以使用。

蔗糖已廣泛用于蛋白質(zhì)制劑配方，海藻糖被認為是比蔗糖更優(yōu)異的凍干保護劑，因為它具有更高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)。海藻糖還具有其他優(yōu)點，例如低吸濕性，不存在內(nèi)部氫鍵，從而與蛋白質(zhì)的氫鍵更靈活，化學反應性低。蔗糖和海藻糖的高粘度也可降低在高于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)的溫度下干燥期間的蛋白質(zhì)變性速率，從而提高冷凍干燥效率。

多元醇廣泛用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，因為它們可以通過其羥基穩(wěn)定蛋白質(zhì)。多元醇已被用作冷凍保護劑和凍干保護劑。例如，在凍融期間，LDH在不同程度上受甘油，木糖醇，山梨糖醇和甘露醇的保護。

聚合物已被用作蛋白質(zhì)溶液和凍干制劑的保護劑。血清白蛋白是用于蛋白質(zhì)藥物開發(fā)的較廣泛使用的聚合物之一，作為凍干保護劑和冷凍保護劑。許多上市蛋白質(zhì)藥物含有不同量的白蛋白(表1)。但是，血清白蛋白具有與血源性病原體相關的潛在污染物，限制了其在蛋白質(zhì)藥物制劑中的使用。因此，建議rHA替代血清白蛋白。最終，建議在沒有白蛋白的情況下開發(fā)蛋白質(zhì)藥物。